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磷酸化酵母葡聚糖抗氧化及免疫增强活性研究

日期:2020-04-10作者:admin 浏览:
        近些年来,多糖由于其免疫增强、抗氧化等功能 而备受关注,成为研究热点。多糖,又称多聚糖,它是由10个以上的单糖分子通过糖苷键相连形成的复杂的聚合物。多糖的复杂的分子结构、单糖组成,主链的糖苷键、分支的类型及聚合程度等决定了其具有各种生物活性。因此,对多糖分子结构进行修饰会对其生物活性产生影响[1]。常见的分子修饰方法有硫酸化、乙酰化、羧甲基化、磷酸化、磺酰化等[2]。
 
        Li等[3]通过对修饰前后多糖抗氧化和抗菌作用比较后发现修饰后的多糖抗氧化活性明显增强,抑菌圈明显增大。Wang等[4]发现,硫酸化后的酵母葡聚糖在体外实验中能够显著增强淋巴细胞的增殖,体内表明能够显著提高血清抗体滴度、血清白介素-2(IL-2)和γ-干扰素(IFN-γ)的浓度。磷酸化多糖是一种重要的多糖衍生物。许多研究表明,磷酸化多糖表现出来良好的抗氧化、抗菌、抗病毒作用[5]。为了研究磷酸化修饰对酵母葡聚糖生物活性的影响,本实验将酵母葡聚糖进行磷酸化修饰,研究其抗氧化活性和免疫增强活性。

        1 材料与方法
        1.1 材料与试剂 酵母葡聚糖购自兰州科进公司。
        三聚磷酸钠(STPP)、三偏磷酸钠(STMP)、1,1-二苯基 -2 - 苦 肼 基 (1,1diphenyl -2 - picrylhydrazyl,DPPH)、抗坏血酸 、焦性没食子酸(pyrogallic acid)、考马斯亮蓝G250、硫酸亚铁、噻唑蓝(MTT)均购自Sigma公司;RPMI 1640培养液、胎牛血清、Hank,s购自Gibco公司;200目细胞筛网、0.22 μm针头滤器(美国Milipore公司生产;二甲基亚砜(DMSO)购自江苏宜兴化学工程公司,所有化学试剂均为分析纯。96孔细胞培养板购自Corning公司。

        1.2 实验仪器 全自动高压灭菌锅(ALP公司)、二氧化碳恒温培养箱(Haraneus公司)、ESCO生物安全柜(Esco科技有限公司)、Nikon Eclipse E200 显微镜(Nikon公司)、酶标仪Multiskan Mk3(Thermo 公司)。

        1.3 实验方法
        1.3.1 磷酸化反应[6]将三聚磷酸钠和三偏磷酸钠混合配成磷酸化试剂,溶解后,加入酵母葡聚糖,加入少量5%的Na2SO4,调pH值,反应一段时间,加入3倍体积的95%的乙醇沉淀24 h,将多糖沉淀真空干燥,再进行复溶,将溶液进行透析,浓缩,真空干燥后得到磷酸化酵母葡聚糖(pGSC)。
        1.3.2 DPPH自由基清除率测定[7]精密称取7.9 mg的DPPH,溶于95%的乙醇中,定容至200 mL 的棕色容量瓶中,配成浓度为0.025 mg的DPPH溶液,避光保存。精密称取200 mg的抗坏血酸,溶于去离子水,定容至100 mL,配成2 mg/mL的溶液,然后依次稀释成1、0.5、0.25、0.125、0.1、0.05、0.025 mg/mL。称取样品50 mg溶于10 mL的去离子水,配成5 mg/mL的样品溶液,然后依次稀释为4、3、2、1 mg/mL的样品溶液。在5 mL的离心管中,分别加入1.5 mL的样品溶液和1.5 mL的DPPH溶液,混匀后,在25℃,黑暗中反应30 min,在517 nm波长处测定吸光度值,记为Ai。DPPH自由基清除率公式:清除率=[Ac-(Ai-Aj)]×100%,Ac:混合溶液中用去离子水代替样品溶液的吸光度值;Aj:混合溶液中用95%的乙醇代替DPPH溶液的吸光度值。
        1.3.3 超氧化物自由基清除率测定[8]先将Tris-HCL(50 mmol/L,pH=8.2)和去离子水在25℃的水浴锅中预热20 min,在15 mL的离心管中分别加入1 mL的不同浓度的样品溶液(5、4、3、2、1 mg/mL,4.5 mL的Tris-HCl,4.2 mL的去离子水,和0.4 mL的焦性没食子酸(50 mmol/L),快速混匀后,在25℃、黑暗中反应5 min。加入8 mmol/L的HCL终止反应,在325 nm的波长处测定吸光度值,记为A1。超氧化物自由基清除率计算公式:清除率=[ A0-(A1-A2)]/A0×100%,A0:混合溶液中用去离子水代替样品溶液的吸光度值;A2:混合溶液中用Tris-HCL代替焦性没食子酸的吸光度值。
        1.3.4 羟自由基清除率测[ 9]在25 mL的容量瓶中分别加入1.5 mL的考马斯亮蓝G250(0.055 g/L),2.0 mL的硫酸(0.1 mol/L),的1.0mL铁标准溶液(1.20 g/L),0.6 mL的过氧化氢溶液(0.12%),3 mL不同浓度的样品溶液(5、4、3、2、1 mg/mL)。用去离子水将容量瓶稀释至刻度,在40℃水浴中加热15 min后,用流水冷却3 min。在582 nm波长处测定吸光度值。记为A1。
羟自由基清除率计算公式:清除率=(A1-A2)/(A3-A2)×100%,A2:混合液中不加样品溶液的吸光度值;A3:混合溶液中不加样品、铁标准溶液和过氧化氢溶液的吸光度值。
        1.3.5 淋巴细胞体外增殖实验 将磷酸化的多糖配成4 mg/mL,然后依次倍比稀释5个浓度,分别记为pGSC1(4 mg/mL)、pGSC2(2 mg/mL)、pGSC3(1 mg/mL)、pGSC4(0.5 mg/mL)、pGSC5(0.25 mg/mL)。 取 4 周龄的KM小鼠,脱臼处死后,在75%的乙醇中浸泡15 min,解剖取其脾脏,在Hanks中清洗后,捣碎分离淋巴细胞,混悬液2 000 r/min离心5 min,加Hanks清洗离心,去除其中的红细胞,分离出淋巴细胞,向细胞中加入完全1640培养液,进行细胞计数。调整细胞浓度为每毫升5×106个细胞。96孔板每个孔加入100 μL的细胞液,100 μL的pGSC多糖溶液,细胞对照组加100 μL完全1640溶液。将96孔板放入5%CO2、37℃培养箱中,培养72 h,第68 小时,每孔加20 μL的MTT,继续培养4 h,然后,2 000 r/min离心5 min,吸取去掉100 μL的上清,再加入100 μL的DMSO,在酶标仪上测其在570 nm波长处的吸光度值作为淋巴细胞增殖的指标。采用SPASS15.0软件对数据进行分析,利用t检验和单因素方差分析对数据进行处理,组间数据多重比较采用Duncan′s法。数据均以平均值±标准差表示。

        2 结果与分析
        2.1 pGSC 对 DPPH 自由基的清除作用 由图1可知,pGSC对DPPH自由基清除作用低于抗坏血酸,但在1 ~5 mg/mL的浓度范围内,pGSC对DPPH自由基的清除效果明显,且随着浓度的增加而逐渐增强。当pGSC浓度为1 mg/mL时,其对DPPH自由基的清除率为32.81%;当pGSC浓度为5 mg/mL时,其对DPPH自由基的清除率为58.99%。其量效分析方程为Y=7.505X+20.383,R2=0.8904,具有一定的量效关系。
        2.2 pGSC对超氧化物阴离子的清除作用 由图2可知,在1 ~5 mg/mL的浓度范围内,pGSC对超氧化物阴离子具有一定的清除作用,随着其浓度增加清除率越高。当pGSC为1 mg/mL时,pGSC对超氧化物阴离子的清除率为50%;当pGSC为5 mg/mL时,清除率为76.25%,其量效关系方程为Y=6.891X+38.482,R2=0.8653,具有一定的量效关系。
        2.3 pGSC对羟自由基的清除作用 由图3可知,虽然pGSC对羟自由基的清除活性低于抗坏血酸,但在一定范围内,其对羟自由基具有较好的清除作用。当其浓度为1 mg/mL时,清除率为33.93%;而浓度为5 mg/mL时,其对羟自由基的清除率为 62.3% ,清除率随着pGSC浓度的增加而逐渐升高。其量效关系方程为Y=7.64X+26.064,R2=0.9537,具有较好的量效关系。
        2.4 不同浓度的 pGSC对淋巴细胞的增殖作用 由表1可知,与对照组相比,试验组对小鼠脾脏淋巴细胞的增殖差异并不显著(P>0.05);但在0.5~4mg/mL的浓度范围内,随着pGSC浓度的增加,淋巴细胞的A570逐渐降低,表明高浓度的多糖会抑制淋巴细胞的增殖。与对照组相比,pGSC浓度为0.5 mg/mL组的A570提高4.76%,表明此浓度可刺激小鼠脾脏淋巴细胞增值,提高其细胞免疫。

        3 讨论
        3.1 磷酸化修饰对酵母葡聚糖抗氧化活性的影响 多糖能够与机体内的多种自由基结合,使自由基减少,达到抗氧化的作用。在机体的新陈代谢的过程中会持续不断的产生自由基,这些自由基包括过氧化氢、超氧化物阴离子和羟自由基等,这些自由基会对细胞结构造成重大伤害,使脂质过氧化或DNA加合物的形成,从而诱发恶性肿瘤[10]、冠心病以及其他与年龄有关的健康问题[11]。尽管,正常机体具有自身的抗氧化的机制,但由于自由基的产生不断增加,自身清除自由基的能力有限,因此,需要找到一种抗氧化的辅助物,降低自由基对机体造成的伤害[3]。DPPH是广泛用于评价抗氧剂清除自由基,发挥抗氧化能力的的物质,它是一种稳定的有机氮自由基,其分子中的氮原子能够接受电子或氢原子,形成稳定的分子[11],在酒精溶液中,DPPH在517 nm处有紫外吸收峰,根据这个原理,评估多糖的抗氧化能力。超氧化物阴离子是在酶系统的自氧化反应中产生的,在所有自由基中,超氧化物阴离子是最早形成的,也促进其他自由基的形成,因此,对超氧化物阴离子的清除能力是反映抗氧化性的重要指标[12]。羟自由基在生物细胞中是通过Fenton反应产生的,它也是活性氧的代表之一,能够很容易的与大多数的生物大分子发生反应。Fenton反应已经广泛用于评价羟自由基清除活性能力[13]。许多研究表明分子修饰后的多糖具有很好的对DPPH、超氧化物阴离子和羟自由基清除效果[14-15],从杏鲍菇里提取的多糖经过硫酸化修饰后,与未修饰的多糖相比,对DPPH、超氧化物阴离子和羟自由基清除显著提高,修饰后的杏鲍菇多糖在1 mg/mL时对DPPH、超氧化物阴离子和羟自由基清除率分别为14.55%、35.10%和23.44%,而在本试验中pGSC5(1 mg/mL)对DPPH、超氧化物阴离子和羟自由基清除率分别为32.81%、50%和33.93%,均高于硫酸化后的杏鲍菇多糖[3]。另外在本试验中,pGSC5对羟自由基的清除率为33.93%,从绿藻中提取的多糖磷酸化后对羟自由基的清除率明显升高,在1 mg/mL的浓度时,磷酸化的多糖(PEP)对羟自由基的清除率为30%[5],与本试验结果相近,但本试验中的pGSC的羟自由基清除率随浓度增加幅度低于PEP。在本试验中分别以DPPH、超氧化物阴离子、羟自由基的清除率作为评价指标,评价pGSC的抗氧化能力,其中对DPPH自由基、超氧化物阴离子和羟自由基的清除率最高分别达58.99%、76.25%和62.3%,呈现出了较好的抗氧化能力。
        3.2 磷酸化修饰对酵母葡聚糖免疫活性的影响 多糖作为一种大分子的生物活性物质,其研究始于20世纪70年代,随着对多糖不断的深入研究,越来越多的生物活性被发现,许多研究表明,多糖具有抗菌、抗病毒、抗肿瘤等作用,这些活性都与多糖的抗氧化和免疫增强活性有关,已有研究证实,在多糖的抗肿瘤作用中,多糖分子并不是直接攻击肿瘤细胞使其致死,而是通过激活机体不同的免疫反应而产生抗肿瘤的作用[16]。在本试验中,与对照组相比,pGSC实验组对小鼠脾脏淋巴细胞的增殖作用并不显著,但在4~0.5 mg/mL的浓度范围内有随着浓度的增加,增殖率逐渐增加的趋势,说明,pGSC对淋巴细胞的增殖具有一定的作用,这与Lai等[17]的灵芝多糖的实验结果一致,在体内实验中灵芝多糖能显著提高脾脏T、B细胞数,而Bao等[18]的灵芝葡聚糖的体外实验中发现该葡聚糖在体外也能促进T、B淋巴细胞的增殖。许多研究还从其他方面来探求多糖分子的免疫调节活性,Chang等[19]通过对虾饲喂白参葡聚糖发现,与对照组相比,葡聚糖饲喂组的虾的存活率显著升高,血细胞吞噬活性增强从而证明葡聚糖的免疫刺激作用,且刺激峰是在饲喂后的24 d出现。Guo等[1]将复合多糖与新城疫和禽流感疫苗联合使用,发现复合多糖实验组在100 mg/kg的剂量时能提高新城疫和禽流感的抗体滴度和淋巴细胞增殖,可以作为安全有效的免疫刺激替代品。Cheng等[20]对甘草多糖的免疫调节活性研究中发现,甘草多糖能显著提高胞饮作用、一氧化氮(NO)、白细胞介素-1(IL-1)、IL-6和IL-12的产生,表明甘草多糖可能通过调节巨噬细胞免疫功能发挥有益的治疗作用。

        本实验是通过体外实验测定磷酸化修饰后的酵母葡聚糖的抗氧化能力和免疫增强活性,探求磷酸化修饰对其活性的影响。在体外实验中,磷酸化修饰后的酵母葡聚糖表现出较好的抗氧化活性和一定的免疫增强活性,但由于体外实验影响因素较为单一,并不能完全模拟机体体内复杂的内环境,因此,需要进一步研究,探究修饰后的葡聚糖在机体内的生物活性。
—摘自【2015 年 第 51卷 第 13 期  Animal Health·动物保健  雷 娜,王 米】


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